NMR - magnetyczny rezonans jadrowy ^[±²]

      powrót                                                           | widmo | interpretacja |

Widmo magnetycznego rezonansu jądrowego powstaje przez wzbudzenie jąder atomowych cząsteczki w próbce umieszczonej w silnym polu magnetycznym (od kilku do kilkunastu tesli), a następnie śledzenie procesu ich powrotu do stanu równowagi (procesu relaksacji). Wzbudzenie następuje poprzez pochłonięcie promieniowania elektromagnetycznego (rzędu kilkudziesięciu do kilkuset megaherców - MHz), którym naświetla się przez ułamek sekundy badaną próbkę. Umieszczenie próbki w silnym polu magnetycznym powoduje, że wektory magnetyczne jąder układają się równolegle do linii sił pola magnetycznego (tak jak igła magnetyczna kompasu w ziemskim polu magnetycznym). Oddziaływanie innych pól magnetycznych cząsteczki (np. pola magnetycznego sąsiednich jąder atomowych) powoduje jednak, że wektor magnetyczny jądra atomowego odchyla się nieco od kierunku zewnętrznego pola magnetycznego i zatacza okrąg precesji. Jeżeli takie jądro naświetlimy promieniowaniem elektromagnetycznym o częstotliwości zgodnej z częstotliwością precesji, może nastąpić zjawisko rezonansu (magnetyczny rezonans jądrowy NMR) i przejście (oczywiście kwantowane !) jądra na wyższy poziom energetyczny. W trakcie procesu relaksacji, który trwa od kilku do kilkunastu sekund od zaprzestania naświetlania próbki promieniowaniem elektromagnetycznym, powracający do stanu równowagi wektor magnetyczny jądra atomowego wzbudza w cewce detektora prąd, który jest rejestrowany. Zapis zmian natężenia i kierunku tego prądu w cewce detektora jest zapisem wszystkichwartości koniecznych do powstania widma. Zapis taki zwany FID (free induction decay) nie nadaje się jednak wprost do interpretacji. Musimy poddać go transformacji Fouriera, otrzymując w wyniku widmo będące zapisem zmian natężenia pochłaniania promieniowania o poszczególnych częstotliwościach. 

Dobierając odpowiednio częstotliwość naświetlania próbki, w stosunku do wielkości pola magnetycznego możemy spowodować w danym doświadczeniu rezonans jąder atomowych wybranych izotopów (najpopularniejszy ¹H-NMR i ¹³C_NMR), warunkiem jest jednak, by jądra danego izotopu charakteryzowały się stałym momentem magnetycznym. Brak momentu magnetycznego wykazują tylko te jądra, w skład których wchodzą równe sobie a jednocześnie parzyste ilości protonów i neutronów. Do takich magnetycznie nieaktywnych jąder zaliczamy izotop węgla ¹²C czy tlenu ¹⁶O, ale już ¹⁴N ma jądro obdarzone momentem magnetycznym, bo ilość protonów, mimo że równa ilości neutronów, nie jest jednak parzysta (wynosi 7). Podstawowe prawo związane z rezonansem magnetycznym mówi, że rezonans danego jądra następuje wtedy, gdy stosunek natężenia pola magnetycznego otaczającego jądro, do wartości częstotliwości promieniowania elektromagnetycznego, którym naświetlamy próbkę uzyska wartość charakterystyczną dla danego jądra. Innymi słowy, identyczne jądra (np. ¹H) w identycznym polu magnetycznym ulegają rezonansowi przy udziale tej samej częstotliwości. Mogłoby się zatem wydawać, że wszystkie protony (¹H) występujące w cząsteczce (czy wszystkie jądra izotopu ¹³C) ulegną rezonansowi przy tej samej częstotliwości i widmo składać się będzie zawsze z jednej linii, odpowiadającej danej częstotliwości. Takie widmo miałoby oczywiście bardzo niewielka wartość w procesie poznawania struktury cząsteczki. Sytuacja taka zaistniałaby w hipotetycznym układzie, gdyby naświetlane były same jądra atomowe a nie, jak to ma miejsce w praktyce, jądra będące składowymi elementami cząsteczki. W tym rzeczywistym układzie jądra atomowe otoczone są chmurą elektronową, która pod wpływem zewnętrznego pola magnetycznego zaczyna tak porządkować swój ruch, by wytworzyć pole magnetyczne skierowane przeciwko zewnętrznemu polu (o przeciwnym zwrocie wektora magnetycznego - diamagnetyzm). Zatem natężenie pola magnetycznego w bezpośrednim sąsiedztwie jądra, od którego wielkości zależy częstotliwość rezonansowa, jest inne niż pola zewnętrznego i różne dla różnych jąder. Jego wielkość jest różnicą (suma wektorową) natężenia pola zewnętrznego i przeciwnie skierowanego pola ekranującego, którego wartość zależna jest głównie od gęstości elektronowej chmury otaczającej dane jądro. Jeżeli wyobrazimy sobie cząsteczkę, w której są dwie grupy –CH₃ - jedna połączona z atomem węgla C–CH₃ a druga z atomem tlenu O–CH₃ to ta druga, na skutek elektroujemności tlenu, będzie charakteryzować się mniejszą gęstością elektronów wokół jąder wodoru niż pierwsza. Zatem każda z tych grup będzie miała inne natężenie pola magnetycznego wokół swoich protonów (jąder wodoru) czego konsekwencją będą dwa sygnały na widmie a nie jeden.

Rejestracja widma.

Widmo NMR rejestruje się praktycznie zawsze dla próbki w postaci roztworu, najczęściej o stężeniu rzędu procentów. Jako rozpuszczalniki stosuje się popularne rozpuszczalniki w postaci pochodnych deuterowanych (deuterowany benzen C₆D₆, metanol CD₃OD, etanol C₂D₅OD, chloroform CDCl₃, dimetylosulfotlenek DMSO itp.). Zastąpienie atomów wodoru atomami jego izotopu deuteru (D, ²H) jest konieczne w przypadku rejestracji widm protonowych, inaczej bowiem bardzo silne sygnały protonów rozpuszczalnika (99%) zagłuszałyby sygnały protonów analitu (około 1%). W zakresie częstości rezonansowych protonów jądra deuteru nie ulegają zjawisku rezonansu. Deuterowane rozpuszczalniki stosujemy także w przypadku widm NMR innych izotopów, gdzie obecność jąder wodoru (protonów) nie przeszkadza z oczywistych względów w rejestracji, natomiast jądra deuteru wykorzystujemy jako czujniki informujące układ automatyzacji rejestracji o sytuacji pola magnetycznego (jego homogenności i wartości natężenia). Pełnią one wówczas rolę sondy pomiarowej pozwalającej utrzymywać przez dłuższy czas, potrzebny do zarejestrowania widma, jednorodność i niezmienność pola magnetycznego w którym przebywa rejestrowana próbka.

Roztwór badany z dodatkiem TMS umieszcza się w szklanych probówkach o średnicy od 3 do 10 mm, wykonanych bardzo precyzyjne, jeśli chodzi o grubość ścianek i ich idealnie kolisty przekrój o stałej średnicy na całej długości probówki. Probówkę umieszcza się w polu magnetycznym o dużej jednorodności i stabilności. Następnie naświetla się przez ułamek sekundy (kilkanaście, kilkadziesiąt mikrosekund) impulsem promieniowania zawierającego wszystkie częstotliwości z danego zakresu (różne dla różnych izotopów). Impuls jest tak dobrany, że powoduje wychylenie wektora magnetycznego próbki (jest to wektorowa suma wszystkich wektorów magnetycznych występujących w próbce) o 90°. Po wygaśnięciu impulsu wzbudzającego następuje rejestracja procesu relaksacji (FID). Jeśli jest potrzeba wzmocnienia stosunku sygnału do szumu (polepszenia widma) powtarza się sekwencję zdarzeń aż do otrzymania żądanej poprawności widma.  FID (lub suma spójnych FID w większej ilości) zostaje komputerowo przeliczona na widmo w dziedzinie częstości (transformacja Fouriera FT), a poprzez uznanie położenia sygnału TMS za początek skali, dalej przeliczona na ppm w skali przesunięć chemicznych δ.

Widmo

Poniżej zaprezentowane widmo paracetamolu można zaliczyć do bardzo prostych i łatwych w interpretacji.

Klasyczny przebieg interpretacji widma rozpoczynamy od odczytania i wpisania w tabelkę podstawowych parametrów widma: 

1. położenia pasma, 

2. krotności rozszczepienia, 

3. stałej sprzężenia spinowo-spinowego, 

4. wielkości powierzchni pod pasmem. 

Każdy z tych parametrów ma swoja wymowę związaną ze strukturą cząsteczki, a porównanie i zintegrowanie wniosków częściowych wynikających z analizy parametrów poszczególnych pasm pozwala z dużym prawdopodobieństwem proponować strukturę cząsteczki badanego związku.

W tabeli pod widmem umieszczono skrócony zapis interpretacji. W podrozdziale Interpretacja troszkę szerzej omówiono poszczególne elementy.
 

7,3	6,7		4,8	3,3	2,1	ppm

Interpretacja ^[±²]

Położenie pasma.

Położenie pasma podajemy w bezwymiarowych jednostkach ppm (część na milion 10^-6), jako część podstawowej częstotliwości pracy aparatu. Dzięki temu w aparatach stosujących różne natężenia pola magnetycznego otrzymujemy taką samą wartość położenia pasma w ppm - zwanego też przesunięciem chemicznym. Bezwzględna wartość przesunięcia chemicznego zależy od natężenia pola i jest do niego proporcjonalna. Silniejsze pole powoduje większe przesunięci w wymiarze bezwzględnym ale stosunek wartości tego przesunięcia do wartości natężenia pola jest stały.

Terminu przesunięcie chemiczne używamy dla podkreślenia faktu, że wartość ta związana jest z położeniem pasma wzorca, którym jest TMS (tetrametylosilan - Si(CH₃)₄). Ponieważ widmo rejestrujemy praktycznie wyłącznie w postaci roztworu, zewnętrzne pole magnetyczne przed dotarciem do jądra atomowego w cząsteczce modyfikowane jest również przez rozpuszczalnik (diamagnetyzm). Z tego powodu częstotliwość rezonansowa tego samego jądra w tym samym związku i w tym samym przyrządzie, ale w różnych rozpuszczalnikach jest różna. To przesunięcie spowodowane rozpuszczalnikiem korygujemy, dodając do próbki przed rejestracją niewielka ilość (poniżej 1%) TMS i uznając pozycje jego pasma za początek skali (umowne zero skali). Położenia pozostałych pasm podajemy jako rosnące wartości w ppm. Właściwości TMS powodują, że praktycznie nie spotyka się jąder atomowych o położeniu ujemnym (poniżej położenia TMS).

Położenie pasma zależy głównie od gęstości elektronowej wokół badanego jądra i od zjawiska tzw. anizotropii diamagnetycznej, czyli specyficznego zakłócania pola magnetycznego przez diamagnetycznie indukowane pola lokalne w cząsteczce, związane ze skupiskiem wysokoenergetycznych elektronów występujących np. w sekstecie aromatycznym czy wiązaniach nienasyconych. Na podstawie położenia pasma w widmie NMR możemy wnioskować o chemicznym charakterze najbliższego otoczeniu analizowanego jądra (elektroujemne podstawniki rozrzedzające chmurę elektronową, wiązania wielokrotne wywołujące zjawisko anizotropii itp.)

Krotność rozszczepienia.

Poszczególne sygnały w widmie NMR nie zawsze występują w postaci pojedynczych linii. Czasem są to podwójne linie o prawie jednakowym natężeniu (dublety, d, patrz widmo, pozycje 6,7 i 7,3 ppm), czasem linie potrójne, w których linia środkowa jest dwa razy wyższa od bocznych (tryplety, t), poczwórne (kwadruplety). To zjawisko rozszczepiania linii związane jest ze zjawiskiem tzw. sprzężenia spinowo-spinowego. Najkrócej można to ująć w stwierdzenie, że jądra z momentem magnetycznym położone najbliżej badanego jądra modyfikują jego pole magnetyczne, powodując w konsekwencji owo rozszczepienie linii. Na podstawie owej krotności rozszczepienia można wnioskować o ilości tych leżących niedaleko i sprzęgających się jąder. Ilość linii w rozszczepionym sygnale jest o 1 większa od ilości jąder rozszczepiających. Jeśli widzimy niedaleko siebie położony tryplet i kwartet, to możemy być prawie pewni, że w cząsteczce występuje ugrupowanie etylowe CH₃–CH₂–

Stała sprzężenia spinowo-spinowego.

Jeżeli w widmie będziemy mieli więcej niż trzy multiplety (dublety, triplety, kwartety itp.) możemy mieć problem z połączeniem ich w sprzęgające się pary. Tu z pomocą przychodzi stała sprzężenia. Jest to odległość między liniami multipletu, wyrażona w hercach. Wartość ta jest dla całego multipletu identyczna (odległości między kolejnymi liniami multipletu są identyczne), ponadto stała ta w dwóch multipletach pochodzących od sprzęgających się grup też jest taka sama. Różne stałe sprzężenia wykluczają możliwość pochodzenia multipletów od sprzęgających się grup atomów. Ponadto, stała sprzężenia nie zależy od zewnętrznego pola magnetycznego a jedynie od struktury cząsteczki. Jej wartość jest identyczna nawet przy rejestracji w różnych spektrometrach i na podstawie wielkości tej wartości też można wyciągać wnioski co do struktury cząsteczki badanej substancji.

Pole pod pasmem.

Wielkości powierzchni pola pod pasmem są proporcjonalne do ilości atomów w grupie chemicznej, której to pasmo dotyczy. Pole pod pasmem protonu grupy hydroksylowej jest dwa razy mniejsze niż pole związane z protonami grupy aminowej NH₂, a to z kolei stanowi dwie trzecie pola sygnału grupy CH₃. Pole powierzchni pod pasmem nie mówi ile atomów występuje w danej grupie, a jedynie jaki jest stosunek tych atomów między poszczególnymi grupami. Jeśli jednak wiadomości o względnych ilościach połączymy z wiadomościami płynącymi z rozszczepienia pasm na multiplety, szybko wartości względne dają się przeliczyć na rzeczywiste.

W przykładowym widmie zamieszczonym powyżej wielkość pola pod pasmem reprezentuje schodkowa linia na tle każdego z pasm. Wysokość "schodka" (skoku między odcinkami płaskimi) jest proporcjonalna do pola, a więc i do ilości protonów, które to pasmo reprezentuje.