Spektroskopia UV Vis (nadfiolet i światło widzialne)
| zasada pomiaru | widmo | geneza widma |Zasady pomiaru
Zakres długości fal elektromagnetycznych, które zaliczamy do zakresu nadfioletu to 100-350 nm. Ponieważ podziału fal elektromagnetycznych na poszczególne zakresy (gamma, UV, IR, radiowe itp.) opiera się na zjawiskach i skutkach jakie wywołują, a nie na rzeczywistych zmianach ich cech (oczywiście poza długością fali), granice podziału nie są ostre a wartości skrajne przyjmowane są dość dowolnie.
Z zakresu ultrafioletu wyodrębniamy tzw. zakres ultrafioletu kwarcowego - 200-350 nm. Jest to zakres wykorzystywany do analizy spektralnej związków chemicznych. Fale z tego zakresu nie są pochłaniane przez kwarc (szkło wytworzone z czystej krzemionki SiO2) - stąd jego nazwa. Na 200 nm kończy się też zakres pochłaniania ultrafioletu przez elektrony wiązań σ (wiązania pojedyncze), co pozwala na użycie do rejestracji widma roztworów w wielu rozpuszczalnikach, które swoją własną absorpcją promieniowania nie przeszkadzają w pomiarach. W zakresie tym pochłaniają energię układy zawierające elektrony π (wiązania wielokrotne i pierścienie aromatyczne) oraz układy z innymi elektronami o niskiej energii przejścia od stanu podstawowego do wzbudzonego. Zakres tych przejść rozciąga się dalej na zakres światła widzialnego (350-900 nm). Należy tu jednak pamiętać, że promieniowanie ultrafioletowe jest pochłaniane przez zwykłe szkło i szklane naczynia oraz szklana optykę stosować można dopiero dla światła widzialnego. W zakresie ultrafioletu musi to być kwarc.
Wychodząca ze źródła promieniowania wiązka zostaje rozszczepiona przez monochromator (siatka dyfrakcyjna, rzadziej pryzmat) na poszczególne fale, tworząc uporządkowane według długości fali continuum. Z tego continuum szczelina wycina wiązkę o bardzo wąskim zakresie długości fal, tak, że traktować ją możemy jako wiązkę monochromatyczną (zawierającą tylko jedną długość fali) o natężeniu Io. Po przejściu tej "monochromatycznej" wiązki przez badany roztwór, traci ona na natężeniu, bowiem część jej energii została zaabsorbowana przez obecne w badanym związku elektrony walencyjne. Po przejściu przez roztwór wiązka ma natężenie Ix. Stosunek natężenia wiązki po przejściu przez absorbujące środowisko do natężenia wyjściowego, wyrażony w procentach nazywamy transmitancją T=Ix/Io. Drugim ważnym pojęciem związanym z pochłanianiem energii promienistej przez substancje jest pojęcie absorbancji (A), którą definiujemy jako logarytm dziesiętny z odwrotności transmitancji
Zatem, jeśli badany roztwór pochłonie 90% promieniowania o danej długości fali, to powiemy, że jego transmitancja przy tej długości fali wynosi 10%, zaś absorbancja będzie wynosić lg(100/10)=1.
Ponieważ podstawowe prawa spektroskopii związane z nazwiskami odkrywców - Lamberta, Beera i Waltera, mówią, że proporcjonalne zależności zachodzą między stężeniem, grubością warstwy absorbującej i absorbancją, ta ostatnia jest częściej używana w praktyce, nie należy jednak zapominać, co ona de facto oznacza. Będąca dziś standardem górna granica pracy spektrofotometrów pozwalająca oznaczać do wartości absorbancji równej 2, oznacza, że aparat jest wstanie mierzyć wiarygodnie natężenia promieniowania 100-krotnie słabszego niż wychodzące ze źródła. Absorbancja równa 3, jako górna granica możliwości aparatu, oznacza już możliwość pomiaru promieniowania osłabionego 1000-krotnie!
Wiązka promieniowania ze źródła trafia do monochromatora, gdzie zostaje rozszczepiona, a następnie przechodząc przez wąską szczelinę (fizycznie - ułamek milimetra) staje się wiązka prawie monochromatyczną. Najczęściej różnice skrajnych długości fal takiej "monochromatycznej" wiązki nie przekraczają w dobrych spektrofotometrach ułamka nanometra (w popularnych, tanich przyrządach osiągają wielkość do kilku nanometrów). Następnie wiązka trafia na wirujące zwierciadło sektorowe, które okresowo zmienia jej bieg. Jeśli trafi na sektor ze zwierciadłem, biegnie dalej drogą przez kuwetę z próbką odniesienia ("ślepą próbą") i dalej do detektora mierzącego natężenie wiązki. Jeśli trafi na sektor pusty, biegnie drogę prowadzącą przez próbkę badaną i dalej do detektora. Detektor otrzymując kolejne sygnały o natężeniu wiązki przechodzącej przez próbkę odniesienia, które traktuje jako 100% natężenia, i próbkę badaną, oblicza absorbancję roztworu badanego. Ponieważ "ślepa próba" najczęściej różni się od próbki badanej tylko tym, że nie zawiera analitu (czyli substancji oznaczanej), obliczona absorbancja dotyczy tylko mierzonego analitu. Rejestrując wartości absorbancji w funkcji zmieniającej się długości fali przechodzącej przez roztwór otrzymujemy widmo. Zmiany długości fali najczęściej uzyskuje się zmieniając w sposób ciągły i automatyczny kąt monochromatora w stosunku do padającej nań wiązki ze źródła promieniowania.
| |  | |
Widmo
Widmo jest to
graficzny zapis zmian wartości absorbancji (lub rzadziej transmitancji) w zależności
od długości fali przechodzącej przez badany roztwór. Głównymi parametrami
widma są:
a - położenie pasm (wartość długości fali przy których na widmie można
wyróżnić maksima; λmax)
b - molowy (lub właściwy) współczynnik absorpcji związany z danym maksimum.
Na podstawie znajomości tych dwóch wartości można, przy zachowaniu pewnych środków ostrożności, wnioskować o podstawowej strukturze cząsteczki. Widmo UV i z zakresu światła widzialnego nie dostarcza niestety zbyt szczegółowych wiadomości, po które należy sięgnąć poprzez wykonanie widma IR bądź NMR. Widmo w ultrafiolecie (a ogólniej cała spektroskopia UV-Vis) służy raczej do określania ilości substancji aktywnej w tym zakresie, wykorzystując prawa absorpcji, z podstawowym na czele, które mówi, że
A = ε· c·l
gdzie: ε - molowy współczynnik absorpcji, równy liczbowo absorbancji, która wystąpiłaby, gdybyśmy mierzyli w danych warunkach roztwór o stężeniu 1 mol/dm3 przy grubości warstwy równej 1 cm; c - stężenie mierzonego roztworu w mol/dm3; l - grubość warstwy roztworu w cm.
Jeśli przy pomocy wzorców o znanych stężeniach obliczymy wartość molowego współczynnika ε, to później znajdując dla nieznanego stężenia tej samej substancji, w tych samych warunkach, wartość absorbancji możemy na podstawie podanego wyżej wzoru obliczyć stężenie tej substancji.
Wiele substancji wykazuje bardzo wysokie molowe współczynniki absorpcji, co wymaga stosowania niskich stężeń, tak aby nie przekroczyć mierzalnej absorbancji (na ogół A<2,0). Stężenia mierzonych roztworów to najczęściej wartości z zakresu 10-4 - 10-6 mol/dm3 (0,01% - 0,00001%). Przy pomiarach w UV należy zachować szczególną czystość odczynników i naczyń, bowiem niewidoczne gołym okiem zanieczyszczenie może dawać absorbancję (i widmo) silnie zakłócające pomiar. Czasem nawet kilka mikrogramów zanieczyszczenia może uniemożliwić prawidłowy pomiar.
| | | |
Geneza widma
Widmo UV jest zapisem pochłaniania energii promienistej przez badaną substancję, a dokładniej jej chromofor (lub chromofory). Pod pojęciem chromofor rozumiemy tę część cząsteczki, która jest bezpośrednio odpowiedzialna za absorpcje promieniowania (w obrębie której zachodzi zjawisko pochłonięcia energii). Najczęściej są to pierścienie aromatyczne (aromatyczny sekstet elektronów), wiązania wielokrotne (ich część - wiązania typu π), zarówno między atomami węgla jak i inne, np. grupy karbonylowej C=O. Ponieważ, jak już wiemy, pochłonięciu ulega jedynie kwant energii o określonej wartości, widmo UV powinno być zbiorem co najwyżej paru (jeśli występuje w cząsteczce parę chromoforów) ostrych linii, bowiem określonemu kwantowi energii odpowiada ściśle określona długość fali, i tylko taka zostanie pochłonięta. Widma, które otrzymujemy w praktyce bardzo różnią się od tego teoretycznego obrazu. Jest to najczęściej zespół 2 - 3 szerokich pasm nakładających się częściowo na siebie.
Dzieje się tak dlatego, że w analizowanym roztworze wiązka promieniowania spotyka na swej drodze bardzo dużo cząsteczek, i choć chromofor każdej z nich jest w stanie pochłonąć tylko jedną, ściśle określona długość fali (kwant energii), to ze względu na różnorakie zmiany energetyczne zachodzące w pozostałej części cząsteczki (np. zmiany energii oscylacji, które możemy obserwować podczerwieni - IR) wielkości kwantów dla poszczególnych cząsteczek nieco różnią się między sobą. Powoduje to w efekcie rozmycie pasma i zamianę pojedynczej linii na szerokie pasmo. Zasadność takiego rozumowania potwierdza zamieszczone poniżej widmo benzenu, zarejestrowane dla benzenu w stanie gazowym (pary benzenu). Ponieważ praktycznie cała cząsteczka jest tu jednym chromoforem, zmiany energii oscylacji i rotacji będą tu wyraźnie odbijać się na energii elektronowej (UV) poszczególnych cząsteczek. Jednocześnie wysoka symetria cząsteczki i praktycznie brak oddziaływań cząsteczkowych (cząsteczki substancji w stanie gazowym pod normalnym ciśnieniem zderzają się ze sobą nader rzadko) powodują powstanie stosunkowo niewielu kombinacji energetycznych, co skutkuje powstaniem dość wyraźnie oddzielonych od siebie podpoziomów energetycznych związanych z oscylacja (linie w widmie) w przebiegu których można zauważyć zmiany związane ze zmianami energii rotacji cząsteczki benzenu ("poszarpania" pasm).
By utwierdzić się w słuszności takiego rozumowania zarejestrowano widmo benzenu w postaci roztworu w metanolu (widmo poniżej). Zwiększona ilość możliwych kombinacji stanów energetycznych oscylacji (modyfikowane oddziaływaniami elektrostatycznymi z dipolem cząsteczki metanolu) i praktyczne zahamowanie rotacji (częste zderzenia cząsteczek w rozworze nie pozwalają na pełne obroty cząsteczek, rotacja występuje tylko w stanie gazowym) spowodowało zanik składowych rotacyjnych (wygładzenie linii pasm) i poszerzenie podpoziomów związanych oddziaływaniem z oscylacją.
Oprócz pojęcia chromoforu w spektroskopii UV używa się drugiego, podobnego w brzmieniu lecz znaczącego coś innego - pojęcia auksochromu. Przez auksochrom rozumiemy różne grupy funkcyjne w cząsteczce, które choć same nie pochłaniają energii z zakresu UV, lecz swoja elektroujemnością wpływają na energię chromoforu. Do najpopularniejszych auksochromów należy grupa aminowa i hydroksylowa. Warto tu zaznaczyć, że grupy te nie są auksochromami z definicji, lecz nimi bywają wtedy, gdy są tak powiązane z chromoforem, że są w stanie wpływać na jego energię. Tak wiec grupa hydroksylowa w fenolu (bezpośrednie powiązanie z chromoforem i możliwość oddziaływania chromofor-auksochrom) pełni role auksochromu, natomiast grupa hydroksylowa w alkoholu benzylowym auksochromem już nie jest (grupa CH2 między hydroksylem i pierścieniem skutecznie blokuje wpływ wolnych par tlenu na pierścień).
Na przykład, jeżeli do cząsteczki benzenu przyłączymy grup aminową (otrzymamy anilinę, fenyloaminę) to jej widmo UV będzie miało maksimum przy innej długości fali niż benzen. Chromofor jest tu ten sam (pierścień fenylowy) lecz możliwość współdziałania z wolną parą elektronową azotu grupy aminowej powoduje zmniejszenie energii przejścia (podnosi energie podstawowa chromoforu - elektronów π pierścienia), a co za tym idzie przesunięcia maksimum absorpcji do fal dłuższych (tzw. przesunięcie batochromowe; przesunięcie w kierunku fal krótszych nazywamy przesunięciem hypsochromowym).
Auksochrom z jednej strony wpływa na wartość energii podstawowego poziomu energetycznego chromoforu, a co za tym idzie również na energie przejścia elektronowego (maksimum pasma), z drugiej zaś strony może oddziaływać z otoczeniem cząsteczki, które z kolei może modyfikować jego siłę oddziaływania na chromofor. Tak więc poprzez auksochrom otoczenie (wartość pH roztworu, polarność rozpuszczalnika itp.) może modyfikować energię chromoforu a więc i energię przejścia, zmieniając tym samym położenie a czasem i kształt widma. Poniżej mamy widmo tej samej substancji zarejestrowane w roztworach o trzech różnych pH (pH=1, kwaśny; pH=7, obojętny i pH=10, zasadowy).
Taki wpływ otoczenia na kształt i położenie widma czasem utrudnia nam pomiary i każe pamiętać, że widmo UV jest charakterystyczne dla danej substancji w danych (określonych) warunkach, z drugiej strony staje się dość przydatnym w badaniach struktury cząsteczki, pozwalając np. określić, czy grupa aminowa ma charakter aromatyczny (auksochrom, wyraźny wpływ pH na położenie maksimum pasma) czy też alifatyczny (połączona z pierścieniem poprzez łańcuch węglowy, widmo nie reaguje na zmiany pH).
| | | |